文丨不知名帅宝
编辑丨不知名帅宝
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(资料图)
前言
微生物细胞壁对于维持细胞形状和抵抗外部应激源至关重要。细胞壁的主要结构成分是肽聚糖，一种位于细胞膜外的具有肽交联的糖聚合物。肽聚糖的生物合成和结构对不断变化的环境条件有反应但这种适应的潜在机制尚不完全清楚。
肽聚糖和其他细胞表面糖聚合物的前体在细胞质中合成，然后通过与可回收脂质载体磷酸十一碳烯酯结合的细胞膜传递。将含有DUF368和DedA跨膜蛋白家族确定为候选C55-P转位酶，填补了微生物细胞表面聚合物生物合成所需蛋白质知识的关键空白。
缺乏同源含DUF368蛋白的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌表现出依赖碱性的细胞壁和活力缺陷，以及细胞表面C55-P水平升高。含DUF368的蛋白质与DedA家族成员之间的pH依赖性合成遗传相互作用表明，C55-P转运蛋白的使用是动态的，并受环境输入的调节。霍乱病原体需要C55-P转运蛋白活性才能在肠道中生长和维持细胞形状。
磷酸化十一碳烯基脂质作为可回收载体分子在微生物细胞表面糖聚合物生物发生中具有重要作用7。在肽聚糖生物合成过程中，在细菌细胞质中组装的肽聚糖的糖联五肽亚基与C55-P共价连接，用于跨膜转运。
在MurJ8将载体连接的肽聚糖前体从膜的内叶移动到外叶后，随后将胞肽掺入聚合的肽聚糖中，留下C55焦磷酸盐。膜相关磷酸酶包括UppP和PAP2结构域蛋白PgpB、YbjG和LpxT7将C55-PP水解为C55-P，从而引发载体循环。
C55-P可能会翻转回膜的细胞质表面以完成回收。初步结构研究提出，UppP也可作为C55-P转位酶发挥作用，但尚未确定负责C55-P内化的蛋白质。C55-P回收是肽聚糖和其他细胞表面糖聚合物生物合成的关键步骤。鉴于其在细胞表面维护中的广泛和关键作用，C55-P回收被认为是抗菌疗法的重要目标，并且已经确定了抑制该过程的天然抗生素。
霍乱弧菌是导致腹泻病霍乱的革兰氏阴性病原体，在进入、转运和离开宿主胃肠道时，其pH值和离子浓度会发生剧烈变化。各种传感和信号网络使霍乱弧菌能够适应不断变化的环境。
病原体通过使用钠动力而不是质子动力来响应改变的盐度和pH值，从而为蛋白质分泌和鞭毛依赖性运动提供动力，并调节毒力基因表达。霍乱弧菌的肽聚糖组成被认为受环境输入的影响，但pH值对霍乱弧菌的影响细胞壁生物学未知。
DUF368影响霍乱弧菌碱性适应性
最近一项针对当代霍乱弧菌临床分离株肠道定植决定因素的体内转座子插入测序筛选确定了许多以前与霍乱弧菌发病机制无关的基因，包括几个功能未知的基因座。选择这些基因之一vca0040进行进一步研究，因为类似的数据集表明霍乱弧菌中对该基因座的普遍需求肠道定植。
VCA0040被预测为一种多通道内膜蛋白，包含功能未知的广泛保守结构域DUF368。VCA0040的预测结构模型具有大的假定裂缝，具有配体结合或转运活性的结构域特征。缺乏VCA0040的霍乱弧菌菌株表现出稳定期生长缺陷，并伴有明显的细胞形状表型，vca0040细胞变成大球体。这些球形霍乱弧菌是有活力的并产生正常的杆状子细胞。
固定相特异性因素可能会触发vca0040细胞的形状缺陷。指数生长的vca0040细胞暴露于来自静止期培养物的无细胞废上清液会迅速诱导球体形成。热不稳定和高分子量因子，以及调节固定相肽聚糖成分的D氨基酸被排除在外。
在LB培养物中，霍乱弧菌进入稳定期伴随着培养基碱化。由于在中性缓冲M9培养基中观察到最小的形状缺陷，假设vca0040细胞对碱敏感。将M9培养基缓冲至不同的pH值显示在pH8时存在生长缺陷，但在pH6或pH7时则没有，并且无细胞废上清液的酸化消除了球体诱导表型。
在缓冲的LB中，vca0040细胞在pH高于8时表现出生长和细胞形状缺陷，但在pH值高达时没有。含有DUF368的蛋白质VCA0040是霍乱弧菌细胞形状完整性和碱性条件下生长所必需的。
DUF368突变体中改变的肽聚糖
DUF368结构域在整个弧菌科几乎普遍保守，并且存在于栖息在广泛生态位的数千种其他革兰氏阴性、革兰氏阳性和古细菌物种中。革兰氏阳性或古细菌DUF368同系物的异源表达至少部分补充了vca0040霍乱弧菌细胞的碱性生长缺陷。两种同源物都显示出与VCA0040的预测结构相似性，表明含有DUF368的蛋白质功能不仅在革兰氏阴性和革兰氏阳性物种之间，而且在整个微生物界中都是保守的。
由于维持细菌细胞形状需要肽聚糖，假设DUF368功能影响细胞壁。vca0040突变体的肽聚糖比野生型少1.5-2倍，并且适度的交联缺陷与肽聚糖前体UDP-N-乙酰胞壁酰五肽的同时积累，表明交叉上游的肽聚糖生物合成缺陷-链接。
这些表型存在于中性pH值下，并因暴露于碱性条件而加剧。与DUF368功能保守的观点一致，S.aureus缺乏SAOUHSC_00846也有碱性生长缺陷、肽聚糖数量减少、UDP-M5积累和交联减少。从这些数据中得出结论，有条件地需要含有DUF368的蛋白质来维持肽聚糖的产生和组成。
DUF368突变体中C55-P循环受损
另外两个观察集中了对DUF368结构域在细胞壁组装上的研究。观察到虽然大多数含DUF368的蛋白质主要由一个或两个DUF368结构域组成，但一些微生物编码具有DUF368-PAP2、PAP2-DUF368或DUF368-BacA结构的双结构域蛋白质。
在vca0040霍乱弧菌的球体形成过程中，pgpB大约有十倍的诱导，它编码C55-PP磷酸酶20。尽管DUF368与C55相关过程存在这些关联，但vca0040突变体在一系列肽聚糖靶向抗生素的最小抑菌浓度中仅表现出轻微增加，这可能是因为大多数细胞壁作用化合物无法穿透革兰氏阴性外膜。
在金黄色葡萄球菌中进行的MIC筛选显示，在碱性条件下，SAOUHSC_00846突变体对安福霉素的敏感性远高于野生型。安福霉素是一种Ca2+依赖性脂肽抗生素，可特异性结合细胞质膜外层的C55-P并抑制其再循环。
与之前的数据一致，已知安福霉素可诱导UDP-M5积累并减少金黄色葡萄球菌中的肽聚糖交联24。SAOUHSC_00846突变体还对衣霉素适度敏感，衣霉素抑制壁磷壁酸和肽聚糖合成的第一个定向步骤和C55-P依赖性步骤以及杆菌肽，杆菌肽结合C55-PP并防止细胞外表面产生C55-P膜。
其他肽聚糖靶向分子的MIC变化很小，为了测试DUF368在革兰氏阴性生物体中的功能，在可渗透外膜并对安福霉素敏感的大肠杆菌菌株lptD421327中异源表达SAOUHSC_00846或vca0040。在lptd4213大肠杆菌中表达任一含DUF368的蛋白质都赋予了两性霉素抗性。
肽聚糖组成和抗生素敏感性数据间接表明C55-P循环在SAOUHSC_00846突变体中受损，特别是在C55-P再内化中。量化了来自野生型和SAOUHSC_00846培养物的膜脂提取物中的C55种类。
野生型金黄色葡萄球菌的安福霉素处理导致C55-P和革兰氏阳性限制性C55-P前体C55-OH28显着积累。该表型在SAOUSHC_00846金黄色葡萄球菌细胞中复制，该细胞在碱性培养基中生长，但在中性条件下不复制或互补菌株，提供了C55-P稳态与SAOUSHC_00846相关的直接证据。
还观察到vca0040霍乱弧菌中C55-P的类似碱依赖性增加。为了具体量化细胞膜外叶中的C55-P，合成了荧光素偶联的两性霉素并用它来标记活细菌细胞。Ampho-FL标记的SAOUHSC_00846金黄色葡萄球菌在碱性培养基中表现出相对于野生型细菌的信号增加，表明突变体中表面C55-P水平有条件地升高。
这些观察结果表明，在含有DUF368的蛋白质突变体中，表面C55-P的碱性积累会引起C55-P合成的补偿性但最终不足的增加，从而导致表面糖聚合物生产缺陷和生长受损。这些发现与模型一致，其中含有DUF368的蛋白质是在碱性条件下活跃的C55-P循环转运蛋白。
DUF368和DedA之间的遗传相互作用
由于C55-P回收被认为是一项基本功能并且DUF368突变体有条件地可行，接下来进行了合成转座子筛选以定义vca0040的遗传网络。许多已确定的合成病态或致死相互作用与细胞包膜稳态有关。
vca0040与N900_RS16280的相互作用最强，它编码大肠杆菌DedA家族成员YghB的同系物。霍乱弧菌表达另外两种DedA蛋白，但这些在这个屏幕上没有命中。DedA家族跨膜蛋白在生命的所有三个领域都是保守的，通常是细胞包膜稳态所必需的，并且被怀疑介导PMF依赖性转运，但它们的具体底物未知。
尽管大多数包含DedA的序列仅编码该域，但有许多域架构实例，其中DedA融合到C55-PP磷酸酶域PAP2。vca0040和yghB的合成致死性通过遗传耗竭和相互合成转座子筛选得到验证，YghB的过表达挽救了vca0040霍乱弧菌的碱性缺陷。
在金黄色葡萄球菌中也观察到了DUF368和DedA蛋白之间的相互作用。在SAOUHSC_00846金黄色葡萄球菌的富碱自发抑制因子中，发现编码两种金黄色葡萄球菌DedA蛋白的基因中频繁出现启动子突变。
将这些突变纳入表达任一DedA蛋白的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷诱导系统甚至在没有诱导的情况下也拯救了SAOUHSC_00846，这表明分离的突变增加了基因表达并补偿了SAOUHSC_00846的缺失，如V.霍乱杆菌。
这些遗传学研究表明DedA家族成员也是C55-P易位所必需的，这与最近的报道一致，即真核DedA蛋白与脂质转运相关，而细菌DedA突变体在C55载体依赖性脂多糖修饰中存在缺陷。
lptd4213大肠杆菌的碱性安福霉素敏感性也支持pH依赖性转位酶贡献的概念，该大肠杆菌仅具有DedA旁系同源物并且没有同源含DUF368的蛋白质。缺乏yghB和vca0040的菌株在酸性pH条件下存活，表明至少一种其他霍乱弧菌蛋白可以进行C55-P易位，或者C55-P可以在酸性条件下自发地穿过膜。
结论
提出含有DUF368和DedA家族的蛋白质是C55-P转位酶，在包膜维护的这一关键步骤中提供功能弹性。C55-P转运蛋白的鉴定暂时填补了C55脂质载体循环途径中的一个主要空白。由于的遗传和表型数据没有明确排除运输独立活动，需要生化和结构研究来确认这两个家族是否确实执行此功能。
这些候选易位酶对适应性的贡献的表观pH和离子依赖性表明这些蛋白质可以在能量上受到控制，因为pH对微生物细胞的主要影响是跨膜离子梯度的控制。含DUF368的蛋白质似乎在PMF较低的碱性条件下贡献最大，如果C55-P易位是能量依赖性的，DUF368介导的转运可能取决于SMF或其他非PMF能量梯度。
vca0040霍乱弧菌对钠离子浓度增加的敏感性以及DUF368在其他已知嗜盐菌如金黄色葡萄球菌和古细菌类嗜盐菌中的明显富集表明，无论它们的能量输入如何，含DUF368蛋白质可能促进微生物适应高盐环境。
VCA0040对霍乱弧菌贡献的钠和pH依赖性生理学可能反映了霍乱病原体在人类小肠中定殖的强大能力，其中可能会出现碱性条件和毫摩尔级钠浓度。除了冗余易位酶的可变保守性，额外的输入和适应机制也可能影响C55-P循环如何促进微生物适应性。
虽然vca0040仅在霍乱弧菌的碱性条件下需要，但即使在中性pH值下，该基因在相关病原体副溶血性弧菌中也是必不可少的，尽管yghB是保守的和抑制基因座，表明DUF368家族活动占主导地位的pH设定点不是普遍的。
尽管含有DUF368的蛋白质——在同时报道的工作中已更名为聚异戊二烯磷酸转运蛋白蛋白质，仅限于细菌和古细菌，但DedA家族成员广泛存在于真核生物中，研究结果可能会影响对聚异戊二烯磷酸酯在所有生命王国中易位的理解。
